藻类细胞破壁方法

细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁,使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术,是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。结合重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展,以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。

微藻有细胞壁,但不同藻类成分不同,且同类细胞结成的网状结构不同,因此其细胞壁的坚固程度不同,总体呈现递增态势。

微藻细胞破碎的方法主要分为化学法和机械法两大类。具体如下:

(一)化学法

1.渗透冲击破碎法

方法:渗透压冲击是较温和的一种破碎方法,将细胞放在高渗透压的溶液中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液),由于渗透压的作用,细胞内水分便向外渗出,细胞发生收缩,当达到平衡后,将介质快速稀释,或将细胞转入水或缓冲液中,由于渗透压的突然变化,胞外的水迅速渗入胞内,引起细胞快速膨胀而破裂。

2.反复冻融法

方法:将细胞放在低温下冷冻(约-15℃),然后在室温中融化,反覆多次而达到破壁作用。由于冷冻,一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂,从而增加细胞的亲水性能,另一方面胞内水结晶,形成冰晶粒,引起细胞膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体,可采用此法。

3.酶溶破碎发法
>方法:利用各种水解酶,如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等,将细胞壁分解,使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感,加入少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后,使之转为对溶菌酶敏感而溶解。

特点:
a) 此法适用多种微生物
b) 具有作用条件温和
c) 内含物成分不易受到破坏
d) 细胞壁损坏的程度可以控制

存在的问题:
a) 易造成产物抑制作用
b) 溶酶价格高
c) 酶溶法通用性差

4。化学试剂法
方法:某些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内含物有选择地渗透出来。SDS(十二烷基磺酸钠)是典型的阴离子表面活性剂。

特点:提取核酸时,常用此法破碎细胞。

存在的问题:
a) 时间长,效率低
b) 化学试剂毒性较强,同时对产物也有毒害作用

通用性差:某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。

 

(二)机械法

1.组织捣碎机

方法:将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。

特点:一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等,转速可高达10000rpm/M以上。由于旋转刀片的机械切力很大,制备一些较大分子如核酸则很少使用。

2。匀浆器

方法:先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎。匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离。制作匀浆器的材料,除玻璃外,还可以用硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂等。

特点:此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织。

存在的问题:较易造成堵塞的团状或丝状真菌,较小的革兰氏阳性菌以及有些亚细胞器,质地坚硬,易损伤匀浆阀者,不适合用该法处理。

3.研磨

原理:将液氮预冻的样本放入研钵内研磨

特点:多用于坚硬植物材料,研磨时常加入少量石英砂,玻璃粉或其他研磨剂,以提高研磨效果。

4.超声波

原理:用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,超声对细胞的作用主要有热效应,空化效应和机械效应。

特点:
a) 处理少量样本,操作简单,重复性较好,节省时间
b) 多用于微生物和组织细胞的破碎,如用大肠杆菌制备各种酶。

存在问题:
a) 超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。
b) 大容量装置声能传递,散热均有困难,应采取相应降温措施。
c) 对超声波敏感和核酸应慎用。

5。高压匀浆

方法:利用超高压能量使样品通过狭缝瞬间释放,在剪切效应、空穴效应、碰撞效应的作用下,使细胞破碎。全过程在4~6℃低温循环水浴中进行,保持原有物质活性。

特点:可连续操作,适合于处理大量样本,主要用于从微生物样本中提取蛋白等胞内产物。

6.振荡珠击破碎

方法:将等体积的小量组织样品与高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋盖微量管中,再加入缓冲液与稳定成份到1。5ml的体积,用6500RPM振荡机高速上下振动8秒,休息8秒,再振动8秒即可。

特点:此方法是目前最快且一次可处理最多样品的方法。一台机器最多可以在一天处理2400支样品。对小量且多样的人很方便。

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