溶藻细菌杀藻物质的研究进展

随着全球水体富营养化的加剧,有害藻类水华的爆发日趋频繁,其造成的环境和经济问题日益引起人们的重视。用铜制剂、除草剂等化学杀藻剂可以直接杀死藻类,但这些化学物质的专一性差,而且容易富集在食物链中造成二次污染。溶藻细菌(algicidal bacteria),作为水生生态系统生物种群结构和功能的重要组成部分,对维持藻类生物量平衡具有非常重要的作用。近年来,不少国外研究者认为:水华的突然消亡可能与溶藻细菌的感染有关。溶藻细菌作为水华防治的可能微生物,已引起越来越多的关注。多数溶藻细菌能够分泌细胞外物质,对宿主藻类起抑制或杀灭作用,因此通过溶藻细菌筛选高效、专一,能够生物降解的杀藻物质已经成为开发杀藻剂的一个新思路。目前国内对溶藻细菌的研究处于起步阶段,而对于细菌杀藻物质的研究尚属空白。鉴于此,作者根据国内外的最新研究成果,对水生生态系统中细菌杀藻物质的作用、种类和研究方法作一概述,并展望了溶藻细菌杀藻物质研究和应用前景。

在海洋和淡水水体中,由于富营养化程度的加剧,藻类过量繁殖形成水华和赤潮,从而影响和改变水体的理化性质,并且能直接或间接引起食藻动物的大量死亡。传统的治理方法如机械除藻,高频电磁脉冲以及利用除草剂等方法,常受到成本和环境安全性问题等诸多因素的限制。相比之下,生物控藻技术成本低、安全性好,其中溶藻细菌因其较高的除藻效力,成为防治水华和赤潮的一个新方向。溶藻细菌(algae-lysing bacteria),作为水生生态系统中生物种群结构和功能的一个重要组成部分,对水华和赤潮的控制、维持藻类生物量的平衡有非常重要的作用,它们对浮游植物的溶解作用也可能是调节水生生态系统中初级生产力的一个重要因素。水华和赤潮的突然消亡可能与溶藻细菌的感染有关。溶藻细菌作为水华和赤潮防治的生物,引起了国内外不少学者的关注,近年来国外不断分离出新的溶藻细菌。相对而言,国内报道较少。近十多年来几乎处于停滞状态。鉴于此,作者根据国内外的最新研究成果,从溶藻细菌的种类、作用方式及机理、筛选与分离、溶藻菌的测定、溶藻效果的评价等方面作一综合概述。

1 溶藻细菌研究概况

所谓溶藻细菌是一类以直接或间接方式抑制藻类生长,或杀死藻类、溶解藻细胞的细菌的统称。溶藻细菌的研究在国外已有数十年历史。早在1924年,Ceitler报道一种粘细菌Polyangium parasitium寄生在刚毛藻Cladophora上,使藻死亡。国内外文献中曾报道过的溶藻细菌种类不一,主要有:粘细菌、噬胞菌属、纤维弧菌属、节杆菌、屈挠细菌属、蛭弧菌、黄杆菌属、弧菌、腐生螺旋体属、假单胞菌、鞘氨醇单胞菌属、交替单胞菌、交替假单胞菌等。这些细菌多为革兰氏阴性菌,它们的作用对象比较广泛,既有蓝藻,也有硅藻和甲藻。

2 溶藻细菌的作用方式及机理

研究溶藻细菌的作用方式不仅可以了解溶藻细菌的作用机制,而且可以为分离和研制高效的杀藻剂提供理论指导。溶藻细菌的作用方式一般分为两种:一是直接溶藻,即直接进攻宿主,它需要细菌与溶藻细胞直接接触,甚至侵入藻细胞内。Shilo M最早报道了粘细菌对蓝藻的直接溶解作用,史顺玉等发现的菌株也是直接溶藻。二是间接溶藻,即间接进攻宿主,主要包括细菌同藻竞争有限营养或细菌分泌胞外物质溶藻。其中分泌胞外物质溶藻文献报道较多,是溶藻细菌的主要作用方式。溶藻细菌可以通过释放特异性或非特异性的胞外物质,如蛋白质,羟胺,抗生素,多肽,氨基酸等杀死藻细胞。报道间接溶藻作用的主要有彭超、Lee Sun-og和 Imamura等。

溶藻细菌对藻细胞作用的可能机理主要有以下5种:直接接触溶藻、释放杀藻物质、细菌与藻竞争营养物、形成菌胶膜及进入藻细胞内杀灭藻细胞。

平安彩票2。1直接接触溶藻

一些溶藻菌直接与藻细胞接触,通过释放可溶解纤维素的酶而消化藻细胞的细胞壁,进而逐渐溶解整个藻细胞。如前所述的黏细菌对蓝藻、鱼腥藻、束丝藻、微囊藻以及多种颤藻的溶解作用;噬胞菌属和腐生螺旋体属能够特异性地与横裂甲藻和硅藻接触,溶解藻细胞等均属直接接触溶藻。

2。2释放杀藻物质

细菌可以通过释放特异性或非特异性的胞外物质杀死藻细胞,目前报道的细菌杀藻物质主要有蛋白质、多肽类物质以及抗生素。这类细菌常见的有弧菌、假单胞菌、黄杆菌、交替单胞菌、假交替单胞菌等。

平安彩票2.3细菌与藻竞争营养物

有些细菌可通过C、N、P、K等物质与藻类产生直接或间接的联系。如芽孢杆菌的生长需要氮磷等物质的营养支持,从而会使水体中的氮磷含量下降,进而使水体无法满足微囊藻的生长需要。同时芽孢杆菌还可以微囊藻藻体作为源加以利用;另外部分真菌和放线菌也会同藻类抢夺有限的营养物质,抑制藻类的生长。

2.4形成菌胶膜

如腐败菌、亚硝酸菌、大肠杆菌、枯草杆菌等大量出现时,单细胞藻类培养物会产生沉淀而颜色变黄,同时发生化学变化而发出氨臭味;另一方面,可在静止的水面集结形成菌胶膜,有碍气体交换和光线的透射,导致水环境恶化,致使藻类死亡。

2.5进入藻细胞内杀死藻细胞

这种溶藻方式极其少见,有人从水华铜绿微囊藻中分离出一种类似蛭弧菌的细菌,这种细菌能够进入铜绿微囊藻的细胞并使藻细胞溶解。

3 溶藻细菌筛选与分离鉴定

目前,溶藻细菌筛选主要有两种方法:一是利用液体感染的方法进行分离;另一种是利用固体感染的方法进行分离。国内外溶藻细菌一般分离自因富营养化而发生水华或赤潮的湖泊及海洋,大多为革兰氏阴性菌。由于溶藻细菌在自然水体中存在的比率比较低,故采用传统的方法需要浓缩大量水样,耗时长且很难获得理想溶藻细菌,与将来工程实际应用相距甚远。PCR技术可以快速、灵敏、选择性地扩增微量的DNA片段,16S rRNA序列分析可以揭示微生物种群间的系统发育关系,利用PCR技术、细菌的16S rRNA序列分析技术,直接分析具有溶藻效果的样品中细菌类属和亲缘关系,根据分析结果选择合适的培养基和方法进行分离培养,能够克服部分溶藻细菌不易培养的弊端,有利于分离更多的溶藻细菌和更全面地了解水环境中的藻菌关系。实际上,国内对溶藻细菌的研究仅处于起步阶段,在分子生物学水平上对溶藻细菌的研究尚未涉及。因此,寻找溶藻细菌分离源,实现短时间内分离筛选获得所需菌株,对溶藻细菌的深人研究及应用具有重要意义。

4 溶藻菌的测定及溶藻效果评价

4.1 溶藻菌的测定

常规用于微生物检验的生理生化方法由于较难检测与判断细菌在空间与时间上的分布,又由于溶藻细菌在自然水体中含量较低,故该类方法不适宜对环境中溶藻菌进行测定。目前发展的溶藻菌在天然水环境中时间与空间分布的检验方法主要集中在分子生物学技术方面。

4.1.1实时定量PCR法

平安彩票采用实时定量PCR技术可定量检测目标溶藻菌如铜绿假单胞菌、芽孢杆菌、交替假单胞菌等的含量与分布。其原理为运用该细菌属的特异性引物,快速检测出目标细菌DNA模板在总DNA模板中的比例,进而推算出目标细菌在样本中的丰度。

4.1.2 PCR-变性梯度凝胶电泳法

采用PCR-变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)测定时,不用对细菌进行富集培养,可根据条带的多少以及明亮程度来判断细菌的多样性以及优势菌群,能够较为准确客观地反映实际环境样本中的细菌时空分布情况。

4.1.3荧光原位杂交法

荧光原位杂交法(FISH)快速便捷,不仅可以定性,而且可以对环境中的细菌进行直接计数,为研究细菌类群的空间分布和数量分布提供了有效的检测工具。但该法要求环境样品中的待测细菌有较高的浓度,并且对于罕见的核酸序列,荧光探针造价较高。

4.2溶藻效果评价

目前筛选溶藻细菌,对溶藻细菌溶藻效果的评价主要从以下几个方面进行:藻液颜色变化;显微镜观察藻细胞的形态特征变化;藻细胞生物量测定;还有通过测定光合效能、丙二醛含量等方法判定细菌溶藻效果。若藻液黄化、藻细胞发生破碎、叶绿素含量下降、光合效能降低以及丙二醛含量增高等,均说明供试细菌具有溶藻能力。

5 以菌治藻需考虑的问题

利用溶藻细菌治理水华,可使水环境保持生态平衡,从而达到防止赤潮的目的。但在以菌治藻的工程实施之前还有大量的工作要开展:

5.1 杀藻作用与细菌的种属特异性的关系。虽然细菌杀藻的现象普遍存在于淡水与海水中,但有时又具有明显的种属特异性。深见公雄等研究细菌的抑藻作用时发现,黄杆菌Flavobactereum sp.对裸甲藻Gymnodinium nagasakiense具有强烈的抑制和杀灭作用,而对Chattonella;Heterosigina akashiwa和骨条藻Skeletonima costatum均无效。这表明该细菌对G.nagasakiense的杀灭作用是专一的。这种情况虽然没有更多的报道,但无疑菌种选择对防治效果而言是关键所在。对不同藻类引起的赤潮要采用不同的细菌,最合适的菌株应该是抑藻强烈而选择性高的种类,并且对鱼类和其他动物无害。

平安彩票5.2 关于投放细菌的量即细菌密度。细菌抑藻有一定的阈值密度,低于这个密度抑藻作用就不会发生。如Flavobactereum sp.抑制Gymnodinium nagasakiense,当细菌密度大于100 000时才会有明显杀藻作用。即时同样的细菌,对不同藻类也有不同的阈值密度。如Shigeki Sawyama等研究细菌杀藻作用,发现一种革兰氏阴性菌NT4可抑制莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii的接合反应。这种细菌也可抑制有毒甲藻Alexandrium catenella的休眠接合子结构,但需要的浓度是抑制莱茵衣藻的128倍。所以细菌的量要足够大才可产生预期的杀藻效果。

5.3 细菌投放的时间。在赤潮发生和演替的过程中,自然菌群的组成也发生着巨大变化,对赤潮藻也有着不同的作用。如长崎裸甲藻Gymnodinium nagasakiense赤潮的开始阶段,菌群对其生长有促进作用,而赤潮消亡时期,则表现为抑制作用。若在赤潮已形成后的早期投放细菌,势必投入大量抑藻细菌才可改变菌群组成以达到抑藻目的;若在赤潮后期投放细菌,则不需太多的量,也可比较有效地促进赤潮的消亡。最恰当的方法是定期检测海洋菌群的组成,如果发现其多样性下降(这往往是赤潮的先兆),立即投放多种抑藻细菌,以维持海洋生态环境的生态平衡,防患于未然。

5。4 海水影响程度。诸多研究表明,细菌的杀藻作用与水环境营养浓度有密切关系。有些细菌的杀藻作用是通过与藻类竞争有限的营养物而使藻细胞饿死。这样的水体中,营养物浓度不会过高。而有些细菌的杀藻作用只有在营养丰富的基质中才会发生,如粘细菌的赤潮(这是较为常见的),就不能不考虑那里的营养程度是否足以为粘细菌杀藻提供可能,如果营养很贫乏,就不能采用粘细菌来防治这样的赤潮。

6 细菌防治的可能途径

6。1 必须分离出对水华及赤潮藻类有特殊抑制效果的菌株。在实验室检测其抑藻效果,测量其最低抑藻浓度等有关指标,对每种细菌建立一个档案,保存起来以备使用。

6。2 细菌或细菌抑藻因子的大量生产。可采用发酵罐大量繁殖抑藻细菌;也可采用基因工程手段,将细菌中产生抑藻因子的基因引入工程菌如大肠杆菌进行大规模生产。

6.3 细菌的投放。大量生产的抑藻菌或抑藻物质制成水剂或片剂,随时可根据需要投放于水体中。若赤潮已发生,则投入抑藻物质;若赤潮尚未发生,则投入抑藻菌以维持海洋菌群的平衡。

平安彩票水华和赤潮的爆发是多种因素综合作用的结果,经验表明,仅靠一种治理方案往往难以取得理想效果。以菌治藻作为水华和赤潮生物防治的一个新对策,尚需其他治理方案的配合,而且还有许多方面值得考虑和进一步探索。只有在生态系统良性循环的基础上以菌治藻,才是溶藻细菌防治水华和赤潮的最佳选择。

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