检测水中藻类的方法

检测水中藻类的方法主要有三种:

1. 藻类检测和计数新方法——置式显微镜法;

2. 改进的水中藻类检测方法;

3.藻类叶绿素及其降解产物的测定方法。

1、藻类检测和计数新方法——置式显微镜法

由于环境污染,一些湖泊富营养化程度不断加剧,导致水中藻类的快速增长。大量藻类的存在,直接影响了自来水的生产和供应。为了了解藻类对水厂各工艺环节的影响,以湖泊水为水源的许多水厂都相继开展了藻类计数检测项目。国内普遍采用的方法是将1L水样加鲁戈试剂固定在一个容器中,自然沉降24h后,利用虹吸的方法吸去上清液,并浓缩定容到3050mL,然后取1mL放入血球计数板,在正置式显微镜下进行镜检计数[1]。此方法由于所需的水样较多(1L),在需要采集多个水样时,采集和运送的工作量大;在沉样时还要多次冲洗转移,增加了产生误差的机会,而且操作不便。昆明自来水总公司的水源之一是富化程度较高的滇池水,因而昆明水司较早开展了此项目,并得到了瑞士苏黎世供水局的技术支持和大力帮助。我们所采用的藻类计数方法的特点是使用倒置式显微镜,藻样通过沉样板一步沉降到位,与国内普遍采用的方法相比具有准确快捷,水样用量少,运送方便,无须多次冲洗转移,操作简单等优点,适用于生产和科研检测。

1.用品准备

1)沉样板。由一个长12cm,宽4.1cm,中央有圆形凹槽(底面积为5cm2)的长方形有机玻璃板和一个可滑动的、底部与凹槽形状完全吻合的空心圆筒(容积为25mL)以及一块圆形盖玻片组成(见图1),有机玻璃板的左侧有一小孔,用于放掉上清液。

1

2)倒置式显微镜。与普通倒置式显微镜不同的是,它的载物台经简单改造,增加了一个长方形的金属框,大小恰好可放置沉样板。金属框的作用是将沉样板固定在载物台上,使沉样板可与载物台同步移动,避免沉样板发生偏移。两个目镜,一个装有微型刻度尺,可直接测量藻类的大小和长度,另一个装有“  ”形标尺,在讦数时用它界定讦数范围。

3250mL试剂瓶。用于盛装水样。

4)移液管(125mL)。

2.药品准备

①鲁戈试剂(Lugols Solution;②福尔马林(40%;③洒精(50%)。

3.方法与步骤

3.1取样

先在250mL试剂中加入67滴鲁戈剂,再加入200mL,左右水样,摇匀。如果水样需保存较长时间,可加入适量福尔马林(40%)。

3.2沉降

用移液管取适量水样加入沉样板,再加入蒸馏水至满,加盖圆玻片,静沉24h。取多少水样,同藻类的多寡而定,藻类数量多可少取,数量少可多取,一般水样体积在1~25mL之间。

3.3计数

将沉样板上的圆筒用盖玻片推开,放掉上清液,置于显微镜上,以目镜上的“工工”形标尺为界线,随机选取若干条带计数。

一般情况是这样计数的;①在10×16倍镜头下,计数全部视野(1cm2)内的大型藻类。②在×25的倍镜下,随机选取5条带,计数基中的中型藻类。③在10×40倍的镜头下,随机选取1条带,计数其中的微型藻类。

在实际运用中,可根据当地的原水藻类情况,确定所选取的条带数。

3.4计算

N= 2

式中——1mL;

5——沉样板板底部圆形凹槽的底面积,cm2;

S——每个计数条带的面积,cm2;

A——选取的条带数;

V——水样体积;mL;

N——实际数的A个条带的藻类个数。

将上述三个放大倍数下计数得的藻类依上式分别计算,再相加,即得到藻类总数。

3.5清洗

计数完毕,用蒸留水冲洗沉样板,浸泡于50%的酒精中过认,再次用蒸留水冲洗后,晾干待用。

4.注意事项

1)沉样前,要将水样摇匀

2)将沉样板的圆筒推开时,要防止产生气泡。

3)将沉样板置于显微镜上时,要尽量保持平衡,避免藻类向一侧倾斜。

4)在选取计条带时,既要注意随机性,又要注意均匀性。

5.实际样品检测

取某水厂原水用上述方法(简称倒置法)和国内普遍采用的传统方法(简称正置法)分别进行藻类检测和计数,结果见表1

3

由表1可见,倒置法水样用量少,并有较高的精密度;正置法水样用量多,精密度较低,而且由于正置法使用的血球计数的容积所限(0.1m3),出现在计数框内的藻类种类也有限,如果需要分类计数,有一定局限性,不好操作。倒置法可以一边分类鉴定,一边分类计数,水样中存在的种类在1cm2的计数范围内基本都能看到,分类鉴定和计数的结果比较全面,操作也方便。另外,倒置法将水样一步沉降到位,省略了许多中间环节,减少了多次冲洗 转移带来的操作误差,从而提高了准确度。

6结论

利用倒置式显微镜进行藻类检测和计数的方法,比使用正置式显微镜的血球计数板法水样用量少,中间环节少,准确快捷,精密度较高,在分类鉴定和计数时,操作较为方便。但该方法使用的沉样板国内尚无厂家生产,需要从国外购买。

二、改进的水中藻类检测方法

水中藻类传统的测定方法是将一定量的水样加鲁哥试剂因定,在筒型分液漏斗中进行自然沉淀,48h后,借助虹吸方法吸去上层清液,按要求浓缩定容到3050ml,然后在镜下计数,由于固定沉降时间较长,检测结果常滞后于生产和研究,影响了及时分析和解决问题。为了解决这一问题,下文对传统的检测蚊法中的沉淀浓缩进行了改进,摸索出一种快速测定藻类的方法,测定时间缩至当天即可出结果,而且准确、可靠,适用于生产和科研检测。

1测定原理

利用测大肠菌的抽滤装置,对检测水样进行抽滤,藻类被截留在滤膜(0.350.65μm)上,利用滤膜对藻细胞的吸附力并不强,用少量纯水在HJ-3型电磁搅拌器上萃取45次就能将全部的藻细胞洗回水中。

滤膜的主要成分是硝化纤维素(CN,可深于丙酮,而丙酮对藻细胞形状基本没影响,当滤膜遇到丙酮后会变成透明胶液,不影响镜下观察检测。

由于丙酮易挥发,滤膜变干会恢复原型,为了保证藻细胞和滤膜的湿度,考虑到丙酮和甘油的相容性,甘油的吸潮性及本身的油脂性,能使藻细胞和滤膜在较长的时间内保持湿润透明,因此,在丙酮溶剂中加了一定比例的甘油,但甘油太多,会影响滤膜的溶解。

2.实验方法

2.1抽滤萃取法

取适量水样,按1001的量加鲁哥试剂固定,在装有滤膜的抽滤器上进行抽滤。取下滤膜,放到100ml的小烧杯里,有藻细胞的一面朝上,加58ml纯水;调好电磁搅拌器转速,使液体搅拌时不会向上溅出,将小烧杯放到搅拌器上转1mim左右,取洗液。

加入纯水58ml纯水;重复上步聚;振洗5次,定空洗液至50ml,在显微镜下记数,计算公工:

N=[(A/Ac)×(Vs/V·Va)]×n

式中,N为每升原水样中的浮游植物数量(个·J-1);A为计数框的体积(ml);n为计数所得藻类数目(个)。

2.2验证法

将上述实验洗净后的滤膜放入一平面皿,在空调下或热源边(不要超过40℃)使滤膜稍干燥,将滤膜放一载玻片上,加二至四滴滤膜透明液,使膜完全溶解成透明胶液,盖上盖玻片,在CHK型显微镜下观察。

此方法也可用来验证传统沉淀法中的弃液藻细胞流失情况。

结果及分析

取已知数量的小球藻9.643×101-1,按上述方法进行回收实验,结果见表1,两种方法在实际水样中的应用结果如表2所示。

传统沉淀方法精确度低,平行样相对偏关在+15%;测试时间较长,根据理论推算,最小的藻为沉时间需要60 ,我们实验静置学时间为43H,常有一些较小的藻细胞随弃液流失,而且在南方地区气温较高,藻细胞大都偏小,易发生流失现象,流失达30%以上。

4

抽滤萃取法能较好地阻止藻细胞流失,但由于滤敢太小,一般只能抽滤浊度10NTU以下的水,对于源水最多只能抽滤200ML左右的水量,太多则滤孔就会被堵 而难以达到抽滤效果,所以存在取水量较少,影响代表性,如有条件,滤膜孔径可取在1。51.8M,对于低浊度的出厂水和滤后水,则不存在这个问题,可抽滤200300ml水量,而且能准确地反映水中残存藻细胞的数量。

传统的沉淀方法中由于染色时间较长,藻细胞和杂质均被染成褐色,在镜下观察时,影响藻细胞的分 而抽滤萃取则没有这种问题,因为藻细胞还保存着很好的原本色泽(绝大多数为绿色)和形状,较容易与水中的细菌、真菌以及低等浮游动物、颗粒、纤维等区分开来。

3、藻类叶绿素及其降解产物的测定方法

下文综述了用分光光度法,荧光检测法及高效液相色谱法测定藻类叶绿素及其降解产物的方法分别详细介绍了各种方法的设备,程序,计算公式及特点.。此外,还介绍了藻类类胡萝卜素的高效液相色谱测定方法。 按测定方法分为六个部分:(1) 叶绿素a , b 的分光光度法测定(三色法) ; (2) 叶绿素的荧光检测法; (3) 存在脱镁叶绿素时叶绿素的分光光度法测定; (4) 存在脱镁叶绿素时叶绿素的荧光法测定; (5) 高效液相色谱(HPLC) 测定藻类的叶绿素及它们的降解产物; (6) HPLC 测定藻类叶绿素及类胡萝卜素。

藻类的特异性色素是叶绿素、叶黄素和胡萝卜素。 浮游藻类里常见的三种叶绿素是叶绿素a ,b c.叶绿素在一切浮游藻类里大约占有机物干重的12 % ,是估计藻类生物量的好指标细胞的叶绿素含量随种类或类群而有所不同,同时还受年龄、生长率、光和营养条件的影响。脱镁叶绿素a (一种叶绿素的普通降解产物能够干扰叶绿素的测定,因为如果存在脱镁叶绿素a ,它能在叶绿素的相同光谱区吸收光和荧光,造成叶绿素值的误差当测定叶绿素的时候还要测定脱镁叶绿素a. 叶绿素和脱镁叶绿素之比可作为浮游植物生理条件的一个良好指标。下文综述了用分光光度法,荧光检测法及高效液相色谱法测定藻类叶绿素及其降解产物的方法:

(1) 叶绿素a , b 的分光光度法测定(三色法) ;

(2) 叶绿素的荧光检测法

(3) 存在脱镁叶绿素a,叶绿素的分光光度法测定

(4) 存在脱镁叶绿素时叶绿素的荧光法测定

(5) 高效液相色谱测定藻类的叶绿素及它们的降解产物; (6) HPLC 测定藻类叶绿素及类胡萝卜素.

叶绿素a , b 的分光光度法测定(三色法)

用丙酮水溶液自浮游生物浓缩样萃取色素,用分光光度计测定萃取物的吸光度。 叶绿素自细胞内提出的难度,不同藻类差异相当大。 为了将色素完全萃出,通常需要用组织研磨器机械的破坏细胞。

111  仪器和试剂

(1) 分光光度计:用窄带的(015210nm) .

(2) 1cm ,4cm 10cm 光程的比色池.

(3) 医用离心机.

(4) 组织研磨器(最好使用圆底的研磨管和捣杆) .

(5) 离心管:15ml ,有刻度和螺帽.

(6) 过滤设备:过滤器,滤膜(0145μ孔径,47mm 直径或玻璃纤维过滤器(GFPC GFPA ,415cm 直径) ,真空泵.

(7)MgCO3 悬浮液:100ml 蒸馏水中加入110g 细粉末MgCO3 .

(8) 90 %(体积比丙酮水溶液。

112  测定程序

(1) 离心或过滤浓缩水样在离心前或过滤的最后一步加入012ml MgCO3 悬浮液.

(2) 把样品置入组织研磨器,23ml 90 %丙酮水溶液覆盖浸泡。

(3) 把样品移入一个有螺帽的离心管,用几毫升90 %丙酮水溶液洗研磨器,并把洗液加入到萃取液

,90 %丙酮水溶液调节体积到510ml .

(4) 在盖紧的离心管中于500g 离心20min 澄清萃取液,把澄清的萃取液倾入一支清洁的,标定过的15ml 有螺帽的离心管并测定萃取液的总体积.

(5) 把萃取液移入1cm 的比色池,750663645 630nm 测定吸光度(OD) 。

113  计算

叶绿素a ,b 的测定分别使用663645 630nm 的吸光度. 750 nm 的读数用来校正浑浊度。 将每个色素的OD 值中减去这个浑浊度校正值后,带入下列公式计算浓度:

(1) 叶绿素a (mgPl) = 11164 (OD663 ) – 2116 (OD645 ) + 0110 (OD630 )

叶绿素b (mgPl) = 20197 (OD645 ) – 3194 (OD663 ) – 3166 (OD630 )

叶绿素c (mgPl ) = 54122 (OD630 ) – 14118 (OD645 ) – 5153 (OD663 )

(2) 各单位体积色素量的计算如下:

叶绿素a (mgPm3 ) = 叶绿素a (mgPl ) ×萃取液的总体积(l) / 水样体积(m3 )

叶绿素的荧光检测法

叶绿素的荧光检测法比分光光度法灵敏,需样品较少而且不要求像分光光度法那样的波长分辨率,430nm 的激发波长和在663nm 的发射波长抽取在试管内测定叶绿素可过的最佳灵感度。

211  仪器和试剂

(1) 荧光计,备有高强度F4 T. 5 蓝光灯,光电倍增管R – 136 (红敏) ,可滑动窗孔,光发射(CS – 2 – 64)

和光激发(CS – 5 – 60) 滤光片,以及一个高灵敏度门.

(2) 其他设备和试剂同111

212  测定程序

(1)  用已知浓度的叶绿素溶液标定荧光计:

用分光光度法测定浓度约为2620 60μgPl 的叶绿素萃取液,再在每一灵敏度位置对每一溶液进行读数,导出标定系数Fs

Fs = CaPRs

式中 Fs ———灵敏度位置的标定系数

Rs ———灵敏度位置的荧光计读数

Ca ———分光光度法测定的叶绿素浓度(μgPl)

(2)  在能够取得适中读数的各灵敏度位置测定样品的荧光,将读数乘以适当的标定系数,得到叶绿素浓度..

 存在脱镁叶绿素时叶绿素的分光光度法测定

由于脱镁叶绿素在接近叶绿素相同的波长上有吸收,因而含有脱镁叶绿素时叶绿素的测定值可能偏高叶绿素由于酸化作用变成脱镁叶绿素a ,吸收峰的值比原来大约降低40 % ,并从663nm 移至665nm ,酸化前后产生的吸收峰之比为1170 ,可用来表观叶绿素的浓度作脱镁叶绿素的校正.

311  仪器和试剂

(1) 111

(2) HCl 1mol·L – 1

312  测定程序

(1) 90 %丙酮水溶液萃取色素,离心澄清,750663nm 读取OD 。

(2) 1cm 的比色池中用两滴1mol·L – 1 HCl 酸化萃取液,轻轻搅拌12min 后在750665nm 读取OD .

(3) 酸化前OD663和酸化后OD665值都减去OD750。

313  计算

使用校正过的值计算叶绿素浓度(C) 与脱镁叶绿素浓度(P)

C(mgPm3 ) = 26173 (663b – 665a)V1PV2L

P(mgPm3 ) = 26173[117 (665a) – 663b ]V1PV2L

式中V1 ———萃取液的体积(l)

V2 ———水样的体积(m3 )

———比色皿液层厚度(cm)

663b ,665a 分别为酸化前后90 %丙酮水溶液萃取的吸光度.

26173 是吸光度校正

存在脱镁叶绿素时叶绿素的荧光法测定

用荧光法测定脱镁叶绿素的浓度,需要测定酸化前后丙酮萃取液的荧光。 叶绿素由于酸化后变成脱镁叶绿素a ,致使荧光降低,利用这一原理进行测定萃取液的脱镁叶绿素浓度。

411  仪器和试剂

(1) 21a

(2) HCl 1mol·L – 1

(3) 纯叶绿素a

412  测定程序

校准荧光计,在每一灵敏度位置测定酸化前后萃取液的荧光计算校准系数(Fs ) ,用酸化前的荧光读数除以酸化后的荧光读数,算出酸化前后的荧光比.

413  计算

叶绿素a (mgPm3 ) = Fs (Rb – Ra) rP(r – 1)

脱镁叶绿素a (mgPm3 ) = Fs (rRa – Rb) rP(r – 1)

式中 Fs ———灵敏度位置的换算系数

Rb ———萃取液酸化前的荧光

Ra ———萃取液酸化后的荧光

———RbPRa

 高效液相色谱测定藻类的叶绿素及它们的降解产物

511  仪器和试剂

除色素提取物外还包括:

(1) 高效液相色谱仪,流速为210mlPm.

(2) 装有100 微升进样环管的高压进样阀.

(3) 保护柱(410 3 015cm , C18 , 3μm)

(4) 反相HPLC (C18 , 10cm , 3μm)

(5) 荧光检测器,波长为430 ±30nm ,可发射超过600nm 荧光.

(6) 数据纪录装置,长条纸记录器或电子积分仪.

(7) 注射器,玻璃,250μL

(8) HPLC 洗脱剂:洗脱剂A(80155 ;甲醇∶Ⅰ型试剂∶离子对溶液) ,洗脱剂B(8020 ;甲醇∶丙酮) .

(9) 校准标准物:分别将1ml 纯叶绿素溶于100ml 90 %丙酮中,用分光光度法测定其准确浓度。 用上述叶绿素标准物经盐酸酸化后制得脱镁叶绿素a + a′和b + b′标准物;从硅藻中萃取叶绿素和脱植基叶绿素a ,酸化脱植基叶绿素制得脱镁叶绿素酸a ,分别用薄层色谱法(TLC) 纯化,分光光度法校准,作为标准物。

512  测定程序

(1) 用洗脱剂A ,流速为210mlPm ,建立和平衡HPLC 系统;校准荧光计的感光度,用叶绿素标样的浓度最大值作为满刻度.

(2) 通过先前制备的标准物校准HPLC 系统的工作标准分别混合叶绿素与脱植基叶绿素a ,脱镁叶绿素和脱镁叶绿素酸a ,作为混合标准物混合1ml 标准液与300μ离子对溶液,平衡分钟后进样混合1ml 90 %丙酮与300μ离子对溶液作为空白液150μ标准液漂洗注射器,注射器中吸入250μ标准液用于进样,将注射器插入进样阀,充满100μ的进样环管。 建立标准色素浓度与荧光峰面积(或高的标准曲线.

(3) 混合1ml 90 %丙酮色素提取物与300μ离子对溶液,作为进样样品.

(4) 使用两步溶剂程序,用于优化叶绿素及其降解产物的分离进样后,5 分钟内将洗脱剂转变为洗脱剂B ,维持B15 分钟,流速为210mlPm. 在下一次进样前,需用洗脱剂重新平衡色谱柱分钟总分析时间约为25 分钟。

(5) 用下列公式计算各色素的浓度

Ci = AsFiVe

PVEVs

式中 Ci = 各色素的浓度mgPl

As = 各次进样的色素峰面积

Fi = 标准响应因子

Ve = 进样体积(011ml)

VE = 萃取体积(ml)

Vs = 样品体积(l)

(6) 这种方法仅用于叶绿素及其降解产物的定量.

(7) 检测限随荧光计结构与流速而变,但对于大多数叶绿素与它们的降解产物来说,每次进样检测限范围在10100pg。 HPLC 法的精确度主要取决于色素标准样的纯度更理想的方法是测定标准样的吸收光谱(350750nm) 并与文献数据相比较色素的纯度也可用HPLC 法来测定,条件是不存在能与标准物的吸收和荧光谱带相重叠的共洗脱污染物如果分光光度法测得的数据经脱镁色素校正,HPLC 的结

果表达为色素当量(例如:叶绿素当量脱植基叶绿素a + 叶绿素a + 叶绿素a,假定使用正确的分子量校正值) ,那么HPLC 法与分光光度法提供的色素浓度与提供的EPA 标准符合得很好。 因此如果明显的存在色素衍生物,用分光光度法测得的数据会偏高HPLC 法与荧光法测得的数据一致则取决于附加的叶绿素b ,c 和它们的衍生物。

 HPLC 测定藻类叶绿素及类胡萝卜素

611  仪器和试剂

除色素提取物外还包括:

(1) 高效液相色谱泵,可进行三种不同溶剂的梯度输出,流速为110mlPm.

(2) 装有200 微升进样环管的高压进样阀.

(3) 保护柱. (50 3 416mm ,C18 ,5μm)

(4) 封尾的反相色谱柱(250 3 416mm ,5μm ,C18 ) .

(5) 可变波长或过滤吸光度检测器,带有低体积流通池,检测波长为436nm.

(6) 数据纪录装置.

(7) 注射器,玻璃,500μL

(8) HPLC 洗脱剂:洗脱剂A(8020 ; 甲醇∶015M乙酸铵,pH 712) ,洗脱剂B(9010 ;乙腈∶水) ,洗脱剂C(乙酸乙酯) .

(9) 校准标准物:叶绿素b ,β,β2胡萝卜素可购买。 其他色素标准物可用TLC 或制备级HPLC 从植物提取物种纯化得到在校准HPLC 系统前,在专用溶剂中使用装有单色器的分光光度计测定所有标准物的浓度。 使用公式:

Ci = 1000 (Aλmax- A750nm)PE1cmb

式中 Ci = 各色素的浓度mgPl

A = 特定波长下的吸光度

E = 吸光系数lPgcm

b = 比色池长度cm

612  测定程序

(1) 用洗脱剂A ,流速为110 mlPm ,建立和平衡HPLC 系统;

(2) 通过先前制备的标准物校准HPLC 系统的工作标准混合1ml 标准物与300μ蒸馏水,摇动,平衡分钟后进样300μ标准液漂洗注射器,注射器中吸入500μ标准液用于进样,将注射器插入进样阀,充满200μ的进样环管。 混合1ml 90 %丙酮与300μ蒸馏水作为空白液。 建立标准色素浓度与荧光峰面积(或高的标准曲线.

(3) 混合1ml90 %丙酮色素提取物与300μ蒸馏水,作为进样样品.

(4) 样品进样采用梯度程序用以优化叶绿素及类胡萝卜素的分离.

(5) 通过比较样品峰与纯标准物峰的保留时间来定性。

(6) 浓度的计算方法同512。 (5)

(7) 这种方法为叶绿素与类胡萝卜素的分离而设计,同时也可以分离主要的叶绿素分解产物。 方法的精确度由测定三倍进样的浮游植物群落和植物的提取物确定使用合适的内标物可提高精确度。

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